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      2022-03-24

      科研新成果!國產納米孔測序助力快速解析多重耐藥病原體完整基因組信息

      來源:齊碳科技官方公眾號

       


       

      細菌耐藥問題如此嚴重,很大程度上是由于耐藥基因在不同細菌中的水平傳播導致,而質粒、轉座子和插入序列等遺傳結構是參與耐藥基因水平轉移的關鍵因子,了解這些關鍵多重耐藥區的基因結構是理解耐藥基因進化與傳播的基礎。

       

      但是,由于耐藥菌基因組的多重耐藥區結構復雜,依據傳統的一代和二代測序技術,很難獲得耐藥菌中多重耐藥質?;蛘呷旧w的精細圖譜。同時,一代和二代測序受限于讀長短,無法跨越關鍵的多重耐藥區,導致無法對參與耐藥基因轉移的關鍵因子如多重耐藥質?;蚱渌退帥Q定區進行系統、深入與高效的分析。

       

      隨著測序技術的快速發展與進步,為現代生命科學和醫學提供了前所未有的便利。利用單分子納米孔測序技術探索細菌的全基因組序列對微生物基因組學的研究具有重要意義。李瑞超教授及其所在課題組致力于將單分子納米孔測序技術應用于多重耐藥質粒結構解析和完整圖譜構建,并以此為基礎,逐漸探索新型測序技術在細菌耐藥性和病原菌檢測等方面的應用。


       

      細菌基因組中一些由許多抗性基因、插入序列和rRNA操縱子組成的復雜區域很難通過短讀測序來解析(Thomsonetal.,2004)。

       

      為了全面評估該納米孔單分子基因測序技術在細菌完整基因組獲取的能力,團隊利用齊碳科技的納米孔測序平臺QNome-9604對4種已報道的MDR菌和2個臨床報道的肺炎MDR克雷伯菌進行了納米孔測序。


      1. 原始數據質量:

      經測序數據質量分析,QNome測序平臺的測序性能良好,測序深度超100X,與參考基因組對比分析顯示,6個樣本基因組的序列覆蓋均質性良好,無測序偏倚。雖然目前堿基錯誤相較二代、一代測序較高,但長讀長的天然優勢仍然可以有效增強細菌基因組的完整性,隨著技術的不斷進步,在通量與準確度提升上齊碳納米孔測序平臺有著無限潛力。

       

      Figure 1. The read features of QitanTech sequencing. a) The distribution of read lengths. b) The relationship between read length and total bases. The unit of the ordinate is Gbp. c) The plot shows relationship between read length and read Phred quality.


       

      Figure 2.  The sequence homogeneity of QitanTech nanopore  sequencing. The ordinate indicates the sequencing coverage (X). The abscissa indicates the genome location.


      2. 組裝結果分析:

      課題組分別進行了短讀長數據、長讀長數據單獨組裝以及混合組裝,并對不同組裝策略所得細菌完成圖進行了對比。

      分析發現,短讀長單獨從頭組裝策略很難識別質粒序列和染色體序列的完整結構。雖然質粒的大小比細菌染色體要小得多,但由于其包含許多抗性基因、插入序列和重復區,往往具有更復雜的結構(Smalla et al.,2015),也是耐藥基因水平傳播的主要載體。獲得完整的染色體序列則有助于助力細菌的毒力島和耐藥島等研究。

      多數情況下,獲得完整的多藥耐藥質粒往往比獲得完整的細菌染色體更困難,長讀長測序在這方面優勢明顯。組裝工具Flye在連續性和準確度上明顯優于Canu,最終6株菌株攜帶的大部分質粒被成功組裝成環狀。

      此次研究課題組也將齊碳QNome平臺數據與Illumina平臺數據進行了混合組裝。相較前兩種策略而言,混合組裝在結合納米孔測序長讀長和二代數據堿基準確率高的優勢下,可以獲得更優的組裝結果。


      通過全面評估齊碳科技納米孔測序儀在不同組裝策略的細菌基因組組裝中的能力,整體上,齊碳QNome平臺生產的測序數據在完整細菌基因信息獲取方面表現良好。

       

      Figure 3. The assembly results of the six genomes using different methods. Every independent line indicates one assembly contig. The individual circular ring indicates circular chromosomes or plasmids


      3. 抗性基因與質粒融合鑒定:

      研究采用不同組裝策略(Flye、Canu、Unicycler),比較了不同組裝方法對細菌所攜帶抗性基因鑒定的影響。結果表明,除菌株ZF2外,Flye和Unicycler組裝的細菌基因組與參考基因組攜帶的抗性基因譜表現一致(圖4)。隨后通過PCR驗證ZF2基因組中缺失的cfr基因,結果為陰性,證明cfr基因缺失并非由測序錯誤引起。

       

      Figure 4. The distribution of antibiotic resistance genes. The resistant genes were identified using ResFinder 4.1 (https://cge.cbs.dtu.dk/services/ResFinder/).


      同時,還對菌株XM9F202-2的基因組特征進行了深入研究,其中包含一條染色體和五個質粒(Li et al.,2021b),并鑒定出細菌增值過程中所發生的質粒融合事件。通過質粒pXM9F202-2-267k與兩個小質粒pXM9F202-2-tetX-90k和pXM9F202-2-186k的線性比較,發現它們共享一個同源區域,該同源區域的重組事件是質粒融合發生的關鍵(圖5)。這種質粒融合的現象有可能促進了質粒的進化,從而增加抗性基因和毒力基因的傳播風險。

       

      Figure 5. Mechanisms of plasmid fusions. a) Comparing the fusion plasmid with its parental plasmids. b) Line comparison of the fusion plasmid and its parental plasmids. c) Schematic diagrams depicting the generation process of the fusion plasmid mediated by homologous regions.



       

      本研究系統全面評價了國內首個納米孔單分子基因測序平臺-齊碳QNome在不同組裝策略下獲取細菌基因組完成圖的能力,總體來說,齊碳科技QNome在識別復雜的細菌基因組特征方面具有較高的分辨率,并且可以很好地解析大多數MDR細菌基因組。同時,利用齊碳科技納米孔測序數據和二代高通量Illumina數據進行混合組裝,可以生成完整性和準確度更高的細菌基因組。


      課題組期待,隨著齊碳科技納米孔單分子測序技術的進步與不斷升級優化,未來將在科研、臨床環境等更廣泛的場景中得到應用。

       

      齊碳科技致力于納米孔基因測序儀及配套試劑耗材的自主研發、制造與應用開發。除了文中提到的QNome-9604平臺外,齊碳科技于2021年12月正式發布了國內首款實現量產的全自主研發納米孔基因測序QNome-3841平臺,可產出1-1.5Gb數據,單次測序準確率達90%,50x數據一致性準確率達99.9%。

       

      除了具備上述納米孔測序平臺的優勢外,還代表了體外診斷設備小型化、便捷化、國產化的發展趨勢,希望在未來更多地應用于臨床、司法、防疫、國防等多元領域。齊碳科技也將不斷探索創新,持續提升產品性能,加速納米孔基因測序儀國產化時代進程!


      特別鳴謝揚州大學李瑞超教授所在團隊對本文的指導!

       


      參考文獻:

      [1]Kai Peng,Yi Yin, Yan Li, et al. QitanTech Nanopore Long-Read Sequencing Enables Rapid Resolution of Complete Genomes of Multi-Drug Resistant Pathogens.Frontiers in Microbiology.doi.org/10.3389/fmicb.2022.778659

       


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